挑選您的流式細胞術 (Flow cytometry) 多色螢光抗體方案
BioLegend 所提供的多色螢光選擇，突破了傳統流式細胞儀 (Flow cytometry) 的限制，同時可兼融光譜流式細胞儀的多色抗體。多色流式細胞儀平台通常都是使用兩種或者多種的一級螢光抗體,去鑑定單細胞上的多重抗原表現，通常多色流式細胞的組合目地,多是為了得到最佳的訊及可有效的觀察細胞群體，以下提供一些 流式細胞儀的工具，幫助您快速找到最合適的螢光抗體。
| (1) 確認實驗室流式細胞儀的配製 |
| 在進行多色螢光抗體的配色時，必須先確認實驗室的流式細胞儀配製: ◆雷射光源的種類，如: 405 nm, 488 nm, 561 nm, 637 nm, 750 nm ◆螢光濾光片的種類 ，如: 450/50, 690/50, 585/42, 660/20 最終確認流式細胞儀可使用的相符合相對應螢光團。 如: 雷射光 : 405 nm / 濾光片 : 450/50 可搭配 Brilliant Violet 421™ 螢光團 |
| (2) 了解待測樣本的表現強弱，選擇適合的螢光團強度 |
| 若待測樣本在總樣本中的數量極少，或者是待測樣本本身標誌表現量低甚至不明，建議使用較亮的螢光團最為選擇，如: PE/PE-Cyanine 5; 反之，若待測樣本本身標誌物表現高，則可以使用亮度較低的螢光團，如: FITC/PerCP。
推薦流式細胞術期刊 Cytometry Part A ，尋找合適的文獻，可做為螢光抗體的配色及流式細胞術試驗時之圈選參考。 |
| (3) 使用 BioLegend 螢光光譜分析器，避免使用發射光譜重疊的螢光團 |
| 除了螢光亮度的選擇外，同時要避免同一支雷射光譜產生的螢光光譜重疊，若遇到螢光光譜重疊的狀況，就會導致實驗結果不準確，並造成判讀上的誤會。同時建議在多色螢光抗體染色上機前，都要進行螢光補償 (Fluorescence compensation) 的調整，才能夠獲得更準確的流式細胞術結果。
使用 BioLegend 螢光光譜分析器，確認螢光光譜是否重疊 |
| (4) 尋找符合的螢光抗體 |
| BioLegend 提供多色螢光抗體挑選工具！ 使用此工具能夠快速的找到您多色螢光方案中，所需要的螢光團抗體。
簡易使用教學: ◆點選所選擇的螢光團及雷射 ◆點選所選擇的物種 ◆點選所選擇的標誌物 ◆點選尋找產品 即可幫您配製好所有相對應螢光的產品，案 + 的選項後， 及可將您選擇的螢光抗體進入您的配色方案中。 |
| (5) 評估待測樣本，選擇合適的緩衝溶劑 |
| ◆若待測樣本標誌物在胞內的話，通常會搭配固定劑以及通透性緩衝液體，BioLegend 提供 True-Nuclear™ Transcription Factor Buffer Set (cat.no 424401)，此試劑可針對胞內轉錄分子染色而設計的緩衝液試劑組，可減少細胞表面螢光染色的干擾 (套組中包含細胞固定液及增強細胞通透性緩衝液)。BioLegend 同時提供一個 Fixation 資料庫，可以查看不同螢光抗體，固定前後的結果差異，讓您可以檢視此抗體是否適合進行固定。
◆若待測樣本染色完，並沒有要馬上進行上機，BioLegend 提供 Cyto-Last™ Buffer (cat.no 422501)，專為保存即將進行胞內細胞激素染色的細胞所設計緩衝溶液，處理完畢的細胞可於4°C穩定保存為期兩週。 ◆進行單細胞的多重抗原表現染色，免不了可能會使用到 tandom dye 的螢光團，而在螢光染色後，若過度固定樣本，可能會導致 tandom dye 螢光團上的鍵結螢光掉落，因此 BioLegend 提供 FluoroFix™ Buffer (cat.no 422101) ，為即用型緩衝液，用於免疫螢光染色後的細胞固定，可幫助穩定 tandom dye，避免產生過度固定後的螢光訊號改變。 ◆若是樣本標誌物為胞內的磷酸化蛋白，BioLegend 提供 True-Phos™ Perm Buffer (cat.no 425401) ，可應用於胞內磷酸化蛋白（如p-STAT6, p-ERK) 和訊息傳遞分子(如Cyclin B1, pan-STAT3) 染色的緩衝液。 |
| (6) 建立實驗對照組 |
| 進行多重螢光染色的試驗時，可能會有許多非特異性的訊號干擾，為了排除可能的干擾因素，提高準確試驗的準確性，必須建立相對的實驗對照組。
◆未染色細胞:避免樣本自體螢光干擾 ◆細胞死活染色試劑: BioLegend 提供多種螢光顏色的 Zombie Dye 水溶性螢光染料， 可用來區分細胞的死活狀態，且在細胞染色後固定，並不影響染色結果，非常適用於多色細胞的染色。 ◆建立同型對照抗體 : (Istotype control antibodies) 的染色樣本，BioLegend 螢光抗體頁面，可在產品詳細 (Product details) 說明處，找到其建議的同型對照抗體，可加快您尋找產品的速度。 ◆Fc Blocking Controls : 可阻斷對 Fc 受器的抗體，避免螢光抗體與細胞產生非特性結合。BioLegend 提供人類細胞使用的 Human TruStainFcX™ (Fc Receptor Blocking Solution) (cat.no 422301) 以及阻斷小鼠 Fc II/III受體的 TruStainFcX™ PLUS (cat.no 156603) 的阻斷緩衝試劑。 |
| (7) 優化染色條件 |
| BioLegend 螢光抗體都已經提供好建議的螢光抗體染色濃度，客戶只需要照著說明書進行，或者微調就可以找到最佳的染色條件。 |