流式應用常見的問題
July 2023 BioLegend x 昶安專欄
流式應用常見的問題
biolegend昶安獨家代理
1. 我發現檢體裡有一些細胞群出現異常的訊號，什麼原因會導致這個現象呢?
抗體標定螢光素常利用polyethylene glycol(PEG)作為鍵結端。某些個體的周邊血液中含有抗PEG抗體，抗PEG抗體達一定濃度，會與螢光抗體形成複合物，因而導致全血染色不清洗的分析中出現異常訊號。
流式技術或影像分析應用在人體相關研究中，常會出現個體與個體間的差異。一些異常的個體中，其特定細胞族群也可能出現異常的訊號。但從2021年初開始，我們並未調整相關產品但卻陸續接獲異常數據回報，我們發現這些數據都是來自曾接受COVID-19疫苗受試者的全血檢體，並以特定螢光素抗體進行染色。
我們發現這些異常的案例，侷限於應用在全血染色，而且這些抗體都是以PEG進行螢光標定。我們的內部數據顯示，這些異常訊號出現的頻率，與個體血清中含抗PEG抗體價數呈正相關。表一列出BioLeged抗體中藉由不同程度PEG鍵結的螢光素。因此，當您使用含PEG的螢光抗體(如表一)，可以依照我們根據實驗數據修正後的操作步驟。
biolegend昶安獨家代理
如果您觀察到螢光染色結果類似以下的圖例(圖一&圖二)，建議依照下列流程進行操作:
- 全血加入4倍檢體體積的cell staining buffer (BioLegend Cat# 420201)。
- 室溫下350g離心5分鐘。
- 去掉上清液體。離心後的全血細胞並非呈現固態的團塊。確認移除上清液後，剩餘體積應相當於起始全血體積。例如，清洗1ml全血，加入4ml cell staining buffer，離心，去除上清液4ml。
- 重複步驟1-3。
- 分裝檢體進行染色。
biolegend昶安獨家代理
表一、BioLegend抗體中已知含PEG的螢光素
Brilliant Violet 421TM |
Brilliant Violet 510TM |
Brilliant Violet 570TM |
Brilliant Violet 605TM |
Brilliant Violet 650TM |
Brilliant Violet 711TM |
Brilliant Violet 750TM |
Brilliant Violet 785TM |
APC/Fire TM 810 |
PE/Fire TM 700 |
Spark Violet TM 538 |
Spark Blue TM 550 |
Spark NIR TM 685 |
圖一、個體間呈現不同程度的異常訊號。根據Lyse wash blood protocol以anti-human CD3-Brilliant Violet 785™進行全血染色。Donor A-預期分布。Donor B & C-多核球中表現不同程度的異常訊號。
biolegend昶安獨家代理
圖二、可用含PEG buffer進行預清洗，或在實驗過程中加入PEG buffer來避免非專一性的異常訊號，但無法以Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution) (BioLegend Cat#422301/2)減少異常訊號的發生。所有檢體都來自同一個受試者，以anti-human CD3-Brilliant Violet 785™進行全血染色，並經由如圖所示之各種不同處理方式。點狀圖圈選自所有白血球族群。<10%陽性多核球訊號視為可接受範圍。
biolegend昶安獨家代li
biolegend昶安獨家代理
2. 何謂f:p ratio?
螢光素 (Fluorescence) 與蛋白 (Protein) 的比例 (F:P)可以讓我們了解每一批抗體產品中，每個抗體上標定螢光素分子的數量多寡。不同廠牌或同廠牌但不同批次間的抗體f:p可能不盡相同。因此當使用同型對照抗體 (isotype control)，需確認使用的同型對照抗體與一級抗體的f:p是否相似。
- 流式實驗中需要設置哪些控制組呢?
- 我們建議每次的流式實驗中都需要設計同型對照抗體 (isotype control) 的組別。同型對照抗體不會辨識任何已知的蛋白，因此可以幫助我們了解在同型抗體染色時的背景值。
- 多色螢光實驗時，則需要設置螢光扣除對照組 (fluorescence-minus-one controls; FMO controls)，以幫助了解來自螢光抗體造成的螢光逸散效應，同時幫助我們圈選正確的陽性與陰性區域。
- 未染色的細胞 (unstained)則是可以幫助了解來自特定細胞的自體螢光 (autofluorescence)。
biolegend昶安獨家代理
3. 固定會影響螢光素嗎?
一般而言以三聚甲醛 (paraformaldehyde) 固定會削減標定在抗體上的螢光強度，且與三聚甲醛作用時間越長影響越大。對於一些奈米微晶或串聯染料，如 PE 和 APC 等，受三聚甲醛的影響最廣。此外，過度的固定步驟也會影響蛋白結構，而減少抗體對蛋白的辨識。
biolegend昶安獨家代理
4. 抗體是如何標定上螢光素的呢?
取決於抗體與螢光素的種類，有幾種不同的方式可以將抗體標定上螢光素。常見的方式是透過抗體上的一級胺 (離胺酸 Lysine)，偶合上有機螢光素。另一個方式是透過抗體鉸鍊區 (hinge region) 上的氫硫基 (sulfhydryl groups)，與帶有馬來醯亞胺 (maleimide) 的螢光素結合。
biolegend昶安獨家代理
5. 如何知道抗體是辨識胞外或胞內的標的物呢?
我們在內部測試中並不會針對抗體進行表位定位分析 (epitope mapping)。如同每一個產品所提供的產品規格所列，我們針對抗體的表面標記染色或胞內染色做品質管控。例如表面標記染色，意指抗體辨識的是胞外表位。如果抗體質控是針對胞內染色，意指該蛋白表現在細胞內，但不代表該抗體僅侷限於辨識胞內，抗體仍有可能辨識表現在細胞膜或運輸至細胞膜上的該蛋白。建議可以同時參考其他文獻使用特定克隆時的表徵。
biolegend昶安獨家代理
6. 我可以將Maxpar® Ready抗體運用在流式應用上嗎?
我們並未測試過將含有 EDTA成分的 Maxpar® Ready抗體應用在流式技術上。理論上大部分的 Maxpar® Ready 抗體可應用在流式技術，但由於在某些狀態下 EDTA可能會影響染色效果，因此仍建議使用同克隆但不含EDTA的抗體應用在流式技術上。
biolegend昶安獨家代理
7. Maxpar® Ready和purified format抗體內含物有什麼不同嗎?
Maxpar® Ready 系列的抗體溶於含有 0.09% NaN3 與 EDTA 的 PBS (pH7.2)中; 常規的 purified format 抗體不含 EDTA。兩種抗體中都不含有carrier proteins。
biolegend昶安獨家代理
8. 已知cyanine相關的螢光素會與單核球非專一性的結合，這樣我還可以應用這些螢光素在單核球染色上嗎?
建議您在第一次染色時先確定在檢體中有多少非專一性的訊號。進行流式染色時遵循Fc blocking與測試抗體最佳稀釋條件，如此可以有效降低背景值。您也可以考慮使用 True-Stain Monocyte Blocker™ (Cat. No. 426101)觀察其是否可以有效改善染色品質。