abcam 抗體標定指南 Antibody Conjugation Guide

Introduction

無論是進行西方墨點法，或使用多重影像系統來形象化腫瘤微環境的表現，通常依賴不同的標的物接合抗體來了解蛋白質的結構、功能、定位和其他蛋白質相互作用。這份指南提供了抗體標定的完整介紹，包括直接與間接測定法的區別、常用的標的物、標的物接合抗體背後的不同化學反應，讓您可使用最適合的方法來進行抗體標定。

Antibody conjugation

抗體標定 (Antibody conjugation)，又稱抗體標記 (Antibody labeling)，是將一個抗體連接到特定標的物或標記的過程。大多數免疫分析方法利用抗體直接與特定標的物標定，或由標定的次級抗體檢測，提供可測量的訊號。

Direct vs indirect assays

如果標的物直接標定到主抗體上，即為直接標定法。如果主抗體未標定，而標的物附著在另一種分子上像是次級抗體，即為間接標定法。

選擇「直接」或「間接」法

兩種方法各具優缺點，您可以參考實驗設計判斷適合的方法。

	直接 (conjugated primary antibody)	間接 (primary antibody + conjugated secondary antibody)
合適性	適合偵測中-高表現的目標物，無須利用次級抗體來放大訊號	適合偵測低表現的目標物，須利用次級抗體來放大訊號
時間	使用標定初級抗體可以減少步驟以縮短實驗時間，只需要經過一次培養即可	使用次級抗體需要花較長時間做培養，需先使用未標定的抗體與檢體反應後，再用標定的次級抗體來與初級抗體反應
花費	價錢通常較高	次級抗體價錢相對來說較低，且可以應用在別的初級抗體上
複雜度	步驟相對簡單，好設計實驗，染劑標定抗體的結合讓您可以有更好的自由度去設計多重因子的分析	需要選擇適合的次級抗體與多個控制組，實驗設計較複雜，這在多因子分析中特別重要，因為需要多個主抗體，每個主抗體針對不同的物種，以及多個相應的次級抗體，每個次級抗體都需接合到不同的染劑
物種交叉反應	由於螢光已經標定在抗體上，因此物種交叉反應已降到最低	除了目標物，次級抗體可能有物種交互反應的情形，可使用預吸附抗體降低物種交叉反應
背景值	使用直接法可降低背景值，因為主抗體已經標定，且不太可能與樣本中的其他抗原反應	在實驗中添加了額外的試劑，次級抗體可能與樣本中的其他抗原發生交叉反應，導致較高的背景值