True-Stain Monocyte Blocker™ - 一種針對單核細胞有效降低抗體非特異性結合的試劑
June 2023 BioLegend x 昶安專欄
True-Stain Monocyte Blocker™: 一種針對單核細胞有效降低抗體非特異性結合的試劑
一些流式染色中經常會用到的偶聯螢光染劑，已被證實在活細胞染色中，會與單核細胞和巨噬細胞進行非特異性 (non-specific binding) 結合。這種影響並不僅侷限於 cyanine 染料家族，非特異性結合會影響這些染料在多色流式分析中低密度抗原檢測的應用。本篇將為大家介紹True-Stain Monocyte Blocker™，它可以消除包括 PE/Cy7，PE/Cy5，PerCP/Cy5.5，APC/Cy7，APC/Fire™ 750 和 PE/Dazzle™ 594 等染料引起的單核細胞和巨噬細胞非特異性結合。加入 Monocyte Blocker 不影響細胞活性，不會降低螢光抗體的信號強度，也不影響其他單核抗原如 CD64 與 CD14 等的抗體結合，多種染料可以同時被阻斷，穩定數據顯示。
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材料與方法
- 收集健康受試者週邊血液，利用Ficoll-Paque (GE Healthcare) 分離週邊血液單核球 (peripheral blood mononuclear cells)。將 PBMC 懸浮於 10%胎牛血清之 RPMI-1640 培養基中，並調整細胞密度為 1x10^6 cells/ml。
- 由 C57BL/6 小鼠腹腔中取出腹腔細胞。
- 細胞刺激條件: 以 5μg/ml ConA (Sigma C-5275) 或 2μg/ml LEAF™ anti-human CD3 (UCHT1; Cat#300401) 與 2μg/ml LEAF™ anti-human CD28 (CD28.2; Cat#302914) 刺激 PBMC 三天。
- 試劑:
| 品名 | 貨號 |
| True-Stain Monocyte Blocker™ | 426102 |
Mouse IgG1 isotype control (clone MOPC-21) |
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| MOPC-21 PE/Cy7 | 400126 |
| MOPC-21 PerCP/Cy5.5 | 400150 |
| MOPC-21 APC/Cy7 | 400128 |
| MOPC-21 PE/Dazzle™ 594 | 400176 |
| Anti-human CD14 PE/Cy7 | 325618 |
| Anti-human CD14 PerCP/Cy5.5 | 325622 |
| Anti-human CD14 APC/Cy7 | 325620 |
| Anti-human CD14 PE/Dazzle™ 594 | 325634 |
| Anti-human CD64 PE/Cy7 | 305022 |
| Anti-human CD3 PE/Cy7 | 300420 |
| Anti-human CD16 APC/Cy7 | 302018 |
| Anti-human CD8 APC | 344722 |
| Anti-human CD4 FITC | 300506 |
- 100μl全血 (或1×10^6細胞懸浮於100ul體積中)，加入含或不含 True-Stain Monocyte Blocker™ 的混合抗體中進行染色 15分鐘。以紅血球裂解液 (Cat #420301) 分解紅血球後，使用細胞染色液 (Cat #420201) 清洗細胞一次。
- BrdU 攝入以 Phase-Flow™ FITC BrdU Kit (Cat #370304) 進行染色分析。
- 以 LEGENDplex™ Human inflammation panel (13 plex) (Cat #740118)分析細胞激素含量
- 以 BD LSRFortessa™、BD FACSCanto™ Ⅱ 及 BD® LSR II 進行細胞分析。以 FlowJo™ 軟體進行數據分析。
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結果
我們利用 PBMC 來驗證 True-Stain Monocyte Blocker™ 是否會對發炎細胞激素/趨化因子產生具有抑制或增強的作用。儘管需要更多的數據得到統計上的意義，根據我們的數據顯示，由兩位不同受試者分離出的 PBMC 加入 CD3 刺激後，同時存在 True-Stain Monocyte Blocker™ 下，對於細胞產生 IL-6、IL-8、IL-10 及 MCP-1 的影響很低，甚至沒有影響 (圖一)。
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圖一、True-Stain Monocyte Blocker™不影響細胞分泌細胞激素。
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我們也測試了True-Stain Monocyte Blocker™對ConA或CD3/CD28抗體刺激PBMC增生的影響，以BrdU攝入法分析細胞增生反應，結果發現True-Stain Monocyte Blocker™存在下不影響ConA或CD3/CD28抗體誘發的T細胞增生 (圖二)。
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圖二、True-Stain Monocyte Blocker™不影響T細胞增生能力。
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圖三、人全血分別以 (A)PE/Cy7、(B)PerCP/Cy5.5、(C)APC/Cy7、(D)PE/Cy5、(E)PE/Dazzle™ 594及(F)APC/Fire™ 750等螢光標記的同型抗體 (MOPC-21) 進行染色。所有 cyanine 染劑皆染上單核細胞(以橢圓框表示，A-F)。由G到L橢圓框中的細胞數減少，表示Monocyte Blocker可有效消除這些非特異性結合。
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圖四、小鼠OPC-21 PE/Cy7進行染色。(A)單核細胞/巨噬細胞與PE/Cy7結合(以紅色箭頭標示)。(B)非特異性結合可被Monocyte Blocker消除。
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圖五、以單核細胞與多核球特有的CD標記: CD14 PE/Cy7、CD64 PE/Cy7 及CD11b PE/Cy7，在(A-C)不含或(D-F)含有monocyte blocker的條件下進行人全血染色。結果顯示無論是否含有monocyte blocker，都不影響單核細胞與多核球染色族群分布。
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圖六、以不含(A)或含有(B)monocyte blocker的CD3 PE/Cy7和CD16 APC/Cy7進行人全血染色。(A)顯示Cyanine對單核細胞的非特異性結合(以紅色箭頭標示)，(B)monocyte blocker可以消除非特異性結合，且不影響CD3/CD16染色族群。樣本中所使用的補償值皆相同。
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圖七、Cyanine染劑與(A)活的單核細胞結合，(C)對於固定過的單核細胞則不影響。以CD3 PE/Cy7進行(A&B)固定前或(C&D)固定后的人PBMC細胞染色。在活細胞染色中，monocyte blocker消除染劑對單核細胞的非特異性結合，而針對固定後的細胞染色則不需要monocyte blocker。
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總結
True-Stain Monocyte Blocker™可以幫助在流式染色中去除cyanine及其相關染料對單核細胞的非特異型結合。