Western blot 疑難雜症大解惑

我明明就按照步驟做，怎麼壓不出來？

Band 怎麼怪怪的？ Today is not my day (T^T) 明明就按照 protocol 做為什麼就是做不好？

又要meeting了 data 出不來怎麼辦？誰來救救我QQ

您是否有遇到 western blot 怎麼壓都壓不出來的煩惱？

你妳你的心聲我們都聽到了！

昶安 Western blot 疑難雜症大解惑為您指點迷津，切勿錯過！

照膠問題

		解決方法
抗體凝集 (Antibody aggregate)
	黑色凝聚點點	離心抗體，取上層抗體 (建議：1000 rpm 5 mins) 替換 blocking buffer
轉漬膜乾燥 (Dried membrane)
	Band 不規則、破碎	轉漬前，務必使用 methanol/ethanol 活化轉漬膜 Membrane 需全程保持濕潤，活化後可先暫時泡在 transfer buffer 中，避免 membrane 乾掉
背景值過高 (High background)
	Membrane 邊邊黑色	增加 Washing 次數與時間 Washing buffer 需確實蓋過 membrane 表面，置於 shaker上均勻搖晃二抗濃度過高，建議增加稀釋倍數 ECL 太強，建議使用訊號較弱的 ECL
Band 中有泡泡 (Bubbles)
	Band 中間有泡泡、斷裂	使用滾輪推平 SDS-page 和 membrane 之間的泡泡更換新的圖畫紙 or 增加圖畫紙 (膠面:膜面 1:2 / 2:1) 壓 (夾) 緊轉漬三明治 (transfer cassette) 更換新的海綿墊
轉漬槽溫度過高/過熱 (Overheating)
	Band 不直，像毛毛蟲	將轉漬槽置於 4°C 冰箱中轉漬在轉漬槽中增加冰盒 or 每小時更換冰盒 (注意：更換冰盒時，切勿移動/取出轉漬三明治) 轉漬時務必維持恆溫的狀態，可加入攪拌棒以低轉速持續攪拌
電壓不穩定 (Unstable power supply)
	Band 不直，像毛毛蟲或 W 形狀	Transfer buffer 離子濃度降低，建議使用新配置 transfer buffer
抗體濃度太高 (High antibody concentration)
	Band過粗、過曝、膜燒掉	抗體濃度過高，建議增加抗體稀釋倍數
檢體蛋白量太高 (High protein amount)
	Band 很粗 Band 曝光後呈現白色狀態 Membrane 燒掉	檢體蛋白量太高，建議降低檢體蛋白量 (一般來說，25 - 30 ug protein 就非常充足了哦)
Blocking 不當 (Inappropriate blocking condition)
	背景出現一條一條刮痕、點點狀	確保 blocking buffer 確實覆蓋整片 PVDF membrane 確保 shaker 沒有傾斜，均勻搖晃 blocking buffer
Band 長短不一 (Inconsistent band size)
	Band 長短不一	SDS-page 凝膠有問題，建議重新凝膠，待膠確實凝固後再使用 (Acrylamide、SDS、APS、TEMED這四個主成分沒有過期/受潮)
背景值光暗不一 (Inconsistent background)
	背景值光暗不一一圈一圈/一坨一坨的背景	抗體孵育不平均，部分 membrane 沒有泡在抗體中，建議加入足夠的抗體，確保抗體蓋過整片 membrane，避免 shaker 傾斜
雜 band 很多 (Multiple nonspecific bands)
		抗體與物種的交互作用 (cross-reactivity) （常見於當抗體和檢體來自於統一物種，此情況建議更換抗體）增加一抗/二抗的稀釋倍數建議延長 stripping 時間 (20-30 分鐘)
Band 燒掉
		檢體蛋白量太高，建議降低檢體蛋白量 (一般來說，25 - 30 ug protein 就非常充足了哦) 避免使用高強度 ECL，建議使用低敏 ECL
Band 糊掉 (Smear)
	Band 拖尾，呈現 smear 狀	檢體製備可能有問題，建議重新磨組織製備檢體 (拖尾狀況一般來說是因為犧牲時檢體保存不當所導致，建議動物實驗收集檢體時務必盡快冷凍，或置於液態氮中，避免蛋白酶引發的蛋白降解作用）