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Western blot 疑難雜症大解惑 Western blot 疑難雜症大解惑

Western blot 疑難雜症大解惑


我明明就按照步驟做,怎麼壓不出來? 

Band 怎麼怪怪的? Today is not my day (T^T) 明明就按照 protocol 做為什麼就是做不好?

又要meeting了 data 出不來怎麼辦?誰來救救我QQ


您是否有遇到 western blot 怎麼壓都壓不出來的煩惱?

你妳你的心聲我們都聽到了! 

昶安 Western blot 疑難雜症大解惑為您指點迷津,切勿錯過!


照膠問題


解決方法
抗體凝集 (Antibody aggregate)

黑色凝聚點點
  • 抗體 ,取上層抗體 (建議:1000 rpm 5 mins)
  • 替換 blocking buffer
轉漬膜乾燥 (Dried membrane)


Band 不規則、破碎
  • 轉漬前,務必使用 methanol/ethanol 活化轉漬膜
  • Membrane 需全程保持濕潤,活化後可先暫時泡在 transfer  buffer 中,避免 membrane 乾掉
背景值過高 (High background)

Membrane 邊邊黑色
  • 增加 Washing 次數與時間 
  • Washing buffer 需確實蓋過 membrane 表面,置於 shaker上均勻搖晃 
  • 二抗濃度過高,建議增加稀釋倍數
  • ECL 太強,建議使用訊號較弱的 ECL
Band 中有泡泡 (Bubbles)


Band 中間有泡泡、斷裂                                                                     

  • 使用滾輪推平 SDS-page 和 membrane 之間的泡泡
  • 更換新的圖畫紙 or 增加圖畫紙  (膠面:膜面 1:2 / 2:1)
  • 壓 (夾) 緊轉漬三明治 (transfer cassette) 
  • 更換新的海綿墊
轉漬槽溫度過高/過熱 (Overheating)


Band 不直,像毛毛蟲





  • 將轉漬槽置於 4°C 冰箱中轉漬
  • 在轉漬槽中增加冰盒 or 每小時更換冰盒 (注意:更換冰盒時,切勿移動/取出轉漬三明治)
  • 轉漬時務必維持恆溫的狀態,可加入攪拌棒以低轉速持續攪拌
電壓不穩定 (Unstable power supply)

Band 不直,像毛毛蟲或 W 形狀
  • Transfer buffer 離子濃度降低,建議使用新配置 transfer buffer
抗體濃度太高 (High antibody concentration)

Band過粗、過曝、膜燒掉
  • 抗體濃度過高,建議增加抗體稀釋倍數
檢體蛋白量太高 (High protein amount)

  • Band 很粗
  • Band 曝光後呈現白色狀態 
  • Membrane 燒掉
  • 檢體蛋白量太高,建議降低檢體蛋白量 
     (一般來說,25 - 30 ug protein 就非常充足了哦)
Blocking 不當 (Inappropriate blocking condition)

背景出現一條一條刮痕、點點狀
  • 確保 blocking buffer 確實覆蓋整片 PVDF membrane 
  • 確保 shaker 沒有傾斜,均勻搖晃 blocking buffer
Band 長短不一 (Inconsistent band size)

Band 長短不一
  • SDS-page 凝膠有問題,建議重新凝膠,待膠確實凝固後再使用
    (
    Acrylamide、SDS、APS、TEMED這四個主成分沒有過期/受潮)
背景值光暗不一 (Inconsistent background)

  • 背景值光暗不一
  • 一圈一圈/一坨一坨的背景


  • 抗體孵育不平均,部分 membrane 沒有泡在抗體中,建議加入足夠的抗體,確保抗體蓋過整片 membrane,避免 shaker 傾斜 

雜 band 很多 (Multiple nonspecific bands)

  • 抗體與物種的交互作用 (cross-reactivity)
    (常見於當抗體和檢體來自於統一物種,此情況建議更換抗體)

  • 增加一抗/二抗的稀釋倍數
  • 建議延長 stripping 時間 (20-30 分鐘)
Band 燒掉
  • 檢體蛋白量太高,建議降低檢體蛋白量
    (一般來說,25 - 30 ug protein 就非常充足了哦)
  • 避免使用高強度 ECL, 建議使用低敏 ECL 
Band 糊掉 (Smear)
Band 拖尾,呈現 smear 狀
  • 檢體製備可能有問題,建議重新磨組織製備檢體 

(拖尾狀況一般來說是因為犧牲時檢體保存不當所導致,建議動物實驗收集檢體時務必盡快冷凍,或置於液態氮中,避免蛋白酶引發的蛋白降解作用)


小編為您統整 western blot 的疑難雜症,希望能夠為您解惑 

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發佈者 發佈時間 Dec 22, 2021 瀏覽次數 3412
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