以41色全光譜流式抗體組合鑑別小鼠淋巴系與骨髓系細胞
以41色全光譜流式抗體組合鑑別小鼠淋巴系與骨髓系細胞
今天要跟大家分享2023年五月發表在Cytometry的文章，作者使用超過二十種以上的BioLegend螢光流式抗體，設計出41色光譜流式螢光抗體組合，用來鑑別小鼠體內的各種免疫細胞群。
為能更深入了解免疫反應，實驗設計常需要同時分析各種不同分子的表現，然而，實際能從器官或組織分離出的免疫細胞數量通常都很少。藉此41色光譜流式螢光抗體組合，不僅可以研究T 細胞及其活化與分化的狀態，偵測細胞上共抑制分子和效應分子的表現，還可以分析抗原呈現細胞上共抑制分子的配體表現。 這個抗體組合能同時分析CD4+ 和CD8+ T 細胞、調節性T 細胞(regulatory T cells)、γδ T 細胞、NK T 細胞、B 細胞、自然殺手細胞(NK)、單核細胞(monocytes)、巨噬細胞(macrophages)、樹突細胞(dendritic cells)及嗜中性球(neutrophils)的表型鑑定。 雖然先前已有各種染色panel用來分別研究這些免疫細胞，但這是首篇文章能夠同時分析這些不同的免疫細胞族群，在有限數量的免疫細胞/樣本下進行全面分析。 這個41色抗體組合目的在於分析和比較不同小鼠傳染病動物模式的免疫反應，也可以延伸應用在其他疾病模式，例如腫瘤或自體免疫疾病等。
文獻中，作者將此41色光譜流式螢光抗體組合(表一)應用於感染Plasmodium berghei ANKA（腦型瘧疾小鼠模式）的 C57BL/6 小鼠脾臟細胞。以Zombie NIR進行死活細胞染色，進行細胞表面標記染色後，細胞經過固定、細胞膜透化後，進行胞內分子染色，最後以5L Cytek Aurora收集細胞並分析。
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表一、OMIP-93使用的抗體列表。
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作者開發了層次結構清晰的圈選策略(圖一)，進而能從這些細胞群體進一步分析其功能指標的表現。以Zombie NIR Live/Dead先排除單一細胞中死細胞的干擾，CD45+圈選免疫細胞族群，首先鑑定出嗜酸性白血球（eosinophils; CD45int SSChi F4/80+ CD11b+）和B細胞（CD19+），接著圈選出γδT細胞（CD3+ TCRγδ+）。進一步將CD3+ TCRγδ−次群分類為NKT細胞（CD3+ NK1.1+）, CD4T細胞（CD4+ CD8−），Treg細胞（CD4+ CD25+ FoxP3+）, CD8+ T細胞(CD4− CD8+)。
在排除B細胞與T細胞後，定義NK1.1+ NK細胞。值得一提的是，這個染色組合還可以通過CD11b和CD27的表現，將NK細胞分成四個不同的成熟階段（CD11blo CD27lo à CD11blo CD27hi à CD11bhi CD27hi à CD11bhi CD27lo）。需特別注意的是，雖然NK1.1於部分小鼠品系並不表達 (例如BALB/c)，但使用NK1.1可以鑑定出iNKT細胞。作者認為這個抗體組合設計應用一些不表達NK1.1的小鼠品系中仍具有很高的價值。
除此之外，OMIP-93還可以鑑定中性白血球（neutrophil; CD11b+ Ly-6G+），CD11b+ F4/80+鑑定單核細胞(monocytes)與巨噬細胞(macrophages)，通過Ly-6C，還可以進一步將細胞區分為典型的Ly-6Chi發inflammation monocytes（相當於人類CD14+ monocytes）和非典型的Ly-6lo resident monocytes （相當於人類CD16+ monocytes）。CD11c可能在T、B和NK細胞次群中表達，但通過圈選邏輯策略可以排除這些細胞族群，作者以CD11c+定義樹突狀細胞（dendritic cells, DC）。DC可進一步分為plasmacytoid DCs（pDC; CD11clo Siglec-H+），它能在活化狀態下產生第一型干擾素（Type I interferons）；conventional DC1（cDC1; CD11c+ CD11b− XCR1+），擅長於cross-presentation；及可誘導Th2免疫反應的conventional DC2（cDC2; CD11c+ CD11b+）。
為進一步分析T細胞次群並分析其活化/分化狀態，該panel使用了anti-CD69、CD25、CD44、CD62L、CD127、CD27及KLRG-1等抗體。例如通過CD44與CD62L指標可以區分Naive（CD62Lhi CD44lo）、central memory（CD62Lhi CD44hi）及效應T細胞（CD62Llo CD44hi）。CD69可以用來區分近期收到活化的B細胞、NK細胞及T細胞，也可以用來區分一些特定組織，如肝臟中由central memory分化為resident memory T細胞的指標。CD27則代表細胞存活能力。KLRG-1則被視為terminally differentiated CD8+ T 細胞的指標，或者進一步分化為memory T細胞過程中則會降低KLRG-1表現；對於NK細胞而言，KLRG-1被視為其抑制分子，也是NK最終成熟過程的標記。
OMIP-93也檢測了可引導T細胞致發炎組織的CXCR3，共刺激分子ICOS、增值標記物Ki-67、效應分子Granzyme B 及 Perforin的表現。此外，該panel還分析了與T細胞耗竭或功能障礙相關的標記，幫助揭示抑制免疫反應的狀態，這些指標含括PD-1、 LAG-3、CTLA-4、TIM-3、TIGIT、BTLA、CD160及CD39。B細胞的TIGIT表達量與維持中樞神經系統耐受性相關。
TIM-3是一種具有多重配體的共抑制分子，其中最廣為人知的配體Galectin-9也包含在這個Panel中。最後作者以可辨識PD-L1 與PD-L2的PD-1作為識別腫瘤治療的免疫抑制狀態。作者為了測試該panel可以分析CD4+和CD8+T細胞是否具有功能性，同時比較受PbA感染或未感染的同胎小鼠並進行細胞染色(圖二)。
圖一、細胞圈選策略。
從 Supporting Information 中可以了解作者如何進行配色設計、多色 spreading error 對 panel 的影響、如何做抗體滴定、及調整了那些配色等資訊。例如從 performin 的抗體滴定，作者混合了其它標抗體幫助判斷圈選，這些操作都有助於減少螢光溢散到鄰近通道。
BioLegend 從 2018年開始，就針對全光譜流式分析推出一系列新穎螢光素抗體，截至目前已經推出超過 20種新螢光素，數量不斷增加，甚至也將死活 Zombie 染劑螢光擴展到11個螢光通道，進而幫助研究人員可以更靈活的運用超多色配色。如果您感興趣，非常歡迎與我們聯繫（vera.chiu@biolegend.com），一起探討這些多色方案。也歡迎您提供資訊，針對您現有的儀器與研究需求，協助您進行傳統/全光譜/質譜流式的 panel 設計，及其後續的操作與數據分析討論。
圖二、從PbA感染（深色）與未感染（淺色）的C57BL/6小鼠脾臟細胞分離的CD4+（藍色）和CD8+T（灰色）細胞直方圖。
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參考文獻
Brandi J, Wiethe C, Riehn M, Jacobs T. OMIP-93: A 41-color high parameter panel to characterize various co-inhibitory molecules and their ligands in the lymphoid and myeloid compartment in mice. Cytometry. 2023; 103(8): 624–630. https://doi.org/10.1002/cyto.a...
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