Aug 2023 BioLegend x 昶安專欄

多色螢光搭配之 Microglia cell 的應用

讓 BioLegend 教你如何從小鼠大腦組織開始，取得單一細胞懸浮液、分離 microglia cell及應用到流式技術

BIOLEGEND 昶安獨家代理

實驗材料

• 1X 胰蛋白酶(Trypsin) 0.25% (GE Lifesciences, Cat#SV30031.01)
• 細胞培養基 (10% FBS & 1% Pen-Strep in RPMI-1640)
• 10X PBS (GE Lifesciences, Cat#SH30258.02)
• 1X PBS (GE Lifesciences, Cat#SH30256.02)
• Percoll (GE Healthcare, Cat# 17-5445-02) 用於去除髓鞘細胞(myelinated cell)
• AO/PI Stain Solution

BIOLEGEND 昶安獨家代理

實驗步驟

取腦組織

1. 使用的小鼠鼠齡超過2週大時，取腦組織前須由左心室以10 ml 1X PBS灌流。
2. 從腦幹開始沿著矢狀縫向上切割，以免損傷大腦組織。

[註: 矢狀縫是將頭骨分成兩半的連接關節。]

1. 將兩半的頭骨剝到一側。
2. 以鑷子挖出大腦並放入裝有PBS的培養皿中。

BIOLEGEND 昶安獨家代理

酵素分解

[由於胰蛋白酶消化對某些表面抗原表位的影響，可以在步驟 7 中以組織均質器取代胰蛋白酶，詳請參考文獻 Garcia JA et al.。]

1. 小心將大腦切割成 6-8等份。
2. 將大腦組織放入 50 ml 離心管中。
3. 在含腦組織的離心管中加入 10 ml 胰蛋白酶，在 37℃ 水浴槽或細胞培養箱反應。每五分鐘溫和地搖勻且反轉離心管，或以10或50 ml長玻璃吸管柱溫和混勻之。
4. 10-15分鐘後，研磨腦團塊直至大部分解離，並添加  20-30 mL 的 RPMI 培養液。研磨時可以使用 12 或 50 mL長玻璃吸管柱上下移液方式。
5. 以 70um 篩網來回過濾3-4次，同時將殘存的團塊溫和均質。
6. 在室溫下 365 g x 5分鐘，重新懸浮於適當的緩衝液中，以 70um 篩網去除沉澱物。
7. 若實驗需要去除髓磷脂 (myelin), 可以將細胞團塊懸浮於含有 37% SIP 的緩衝液中 (比例為 4 ml 緩衝液作用反應於一個大腦組織)，並接著下列步驟進行。

或可以直接進入細胞分離、流式分選或流式技術應用。

如果實驗需保留 myelin，則將細胞團塊回溶於 PBS 並置於冰上。

(可選擇步驟)去除 myelin 以分離出微膠細胞 (microglia) 與淋巴球細胞 (leukocyte)

• Isotonic Percoll (SIP): 混合比例為1:9的10X PBS : percoll
• 70% percoll: 7 ml SIP + 2.0 ml 1X PBS
• 37% percoll: 3.7 ml SIP + 5.3 ml 1X PBS
• 30% percoll: 3.0 ml SIP + 6.0 ml 1X PBS

1. 取出 4 ml 懸浮於37% SIP 的細胞液至 15ml 離心管。
2. 緩慢地加入 4 ml 70% percoll, 再加入4 ml 30% percoll, 最後加入2 ml 1X PBS (請緩慢加入以避免破壞分層界面)。最後離心管由上至下應為: 2 ml 1X PBS, 4 ml 30% percoll, 4 ml 懸浮於 37% percoll的細胞液, 4 ml 70% percoll。

[註: 如果需要處理一個以上的大腦組織，請勿依照比例放大反應體積，每15 ml離心管僅能處理一個大腦組織。]

1. 室溫下以緩慢升速與降速離心 300g x 40分鐘。
2. 以吸移管將 1X PBS 與30% percoll 移除，這些介面中含有 myelin。
3. 使用新的吸移管將介於70% & 37% percoll間的界面取出來，此界面富含 microglia & leukocytes，請勿丟棄! 將這些細胞置於新離心管中。
4. 加入3倍體積的 1X PBS至 microglia cells中，以用來稀釋 percoll，在室溫下離心 365g x 5分鐘。
5. 將細胞團塊重新懸浮於 1X PBS 中，進行細胞計數。
6. 可接著進行細胞純化、流式技術螢光染色、或流逝分選等其他應用。

[註:以此步驟進行細胞分離，一隻成鼠大約可取得 2x10⁵~400,000 顆 microglia cell。]

BIOLEGEND 昶安獨家代理

數據呈現

以 MojoSort™ Mouse P2RY12 Selection Kit 進一步純化經由大腦組織處理步驟的細胞 (步驟18)。利用陽性分選磁珠純化出 P2RY12+ 細胞後，以 anti-mouse P2RY12 (clone S16007D) PE與 anti- mouse CD11b (clone M1/70) Brilliant Violet 421™ (左圖) 或 anti-mouse CX3CR1 (clone SA011F11) APC (右圖) 鑑別細胞純度。 死細胞以 7-AAD排除之。

BIOLEGEND 昶安獨家代理

參考文獻

Garcia JA. et al. 2014. Curr Protoc Immunol.

回上頁