如何選擇適合的流式緩衝液?
在流式細胞分析實驗中，除了螢光偶聯的抗體以外，緩衝液也扮演這非常重要的角色！
BioLegend 提供一整套完整的緩衝液，根據不同的實驗需求選擇適合的緩衝液，協助樣本的準備、儲存，以及表面、細胞內和細胞核抗原的染色，協助科學家在每次的實驗中有最佳的染色效果！
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如何選擇適合的流式緩衝液?
為流式實驗選擇合適的緩衝液，是取得良好的實驗數據與可靠的實驗結果的必備入場券。希望藉由這篇文章可以幫助您在實驗中選擇正確的緩衝液。
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Q1. 樣本製備通常推薦用哪一種緩衝液呢？
該如何選擇正確的緩衝液，必須先從您的研究假說與生物樣本的特性來決定。如果您正在處理血液、骨髓或脾臟細胞等富含紅血球的組織，以下緩衝液可以提供選擇:
Lymphopure™（Cat#426201/426202）是一種密度梯度分離液，可以幫助您從經抗凝血的全血中分離出 PBMC，以去除紅血球、血小板和多核球的干擾。
RBC Lysis Buffer (10X)（Cat#420301/420302）可以從全血中破除紅血球，保留活的免疫細胞。
RBC Lysis/Fixation Solution (10X)（Cat#422401）是一種可以從全血中破除紅血球，同時固定免疫細胞的緩衝液。
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Q2. 表面染色和細胞內染色有什麼區別？
行抗體染色後，用細胞染色緩衝液 Cell Staining Buffer（Cat#420201）洗去多餘的抗體。進行細胞內染色需要抗體能進入到細胞內對特定分子進行標記，雖然一些化學探針可以直接穿透細胞進入胞內，但當用螢光或寡核苷酸標記的抗體進行胞內染色時，就需要選擇合適的緩衝液對細胞進行處理，使抗體能進入到細胞內，對細胞質或者細胞核的分子進行染色。
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Q3. 為什麼需要先固定細胞（fixation），然後再進行透化（permeabilization）？
對細胞進行固定可使細胞暫停在某個生物狀態，增強了細胞的透化和胞內染色效果，並且可提供實驗安排的靈活度。為此，BioLegend 根據不同的流式檢測目的，將相應的緩衝液整理列出如下。包含適用於表面染色（表一）或胞內/核內染色（表二）的緩衝液，以及每種染色所需的緩衝液組合方案。
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表一、適用於表面染色的緩衝液。
| Tissue/Cells/Whole Blood | Apotosis (Annexin V) | |
| Surface staining | Cell staining buffer (CAT#420201) | Annexin binding buffer (CAT#422201) |
| Fixation | Fixation buffer (CAT#420801) | Fixation buffer (CAT#420801) |
表二、適用於各式胞內染色的緩衝液組合。
| Cytokines | FOXP3/Helios/Transcription Factors | Phospho Targets | BrdU | |
| Surface staining | Cell staining buffer (CAT#420201) | Cell staining buffer (CAT#420201) | Cell staining buffer (CAT#420201) | Cell staining buffer (CAT#420201) |
| Fixation | Cyto-Fast™ Fix/Perm Buffer Set (CAT#426803) | True-Nuclear™ Transcription Factor Buffer Set （CAT#424401) | Fixation buffer (CAT#420801) | Fixation buffer (CAT#420801) |
| Fixation buffer (CAT#420801) | ||||
| Permeabilization | Cyto-Fast™ Fix/Perm Buffer Set (CAT#426803) | True-Nuclear™ Transcription Factor Buffer Set （CAT#424401) | True-Phos™ Perm Buffer (CAT#425401) | 0.5% Triton-X 100 in PBS |
| Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X) CAT#421002 |
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Q4. 為什麼相較於自製的緩衝液，我們更推薦使用 BioLegend 的緩衝液呢？
往往實驗到最後上機分析才知道整個操作步驟是否成功且正確，因此在實驗一開始即選擇正確的緩衝液是實驗成功關鍵決定步驟。自製緩衝液可能是有效的，但 BioLegend 緩衝液是在嚴格的品質管制體系下生產的，且針對特定應用進行質控評估，使用品管一致的緩衝液對於能每次成功執行流式抗體染色有莫大的幫助。
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Q5. 我可以混合搭配不同廠牌的抗體試劑和緩衝液嗎？
雖然 BioLegend 緩衝液是使用 BioLegend 抗體和蛋白進行測試和驗證的。但理論上，是可以將 BioLegend 緩衝液與其他供應商的抗體試劑一起合併使用。針對這項需求，我們在官網上列出了常見緩衝液的等效產品供使用者查閱 (表三)：
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表三、常見緩衝液的等效產品。
| 品名 | 型號 | 品名 | 型號 |
| 7-AAD Viability Staining Solution | 420403 | BD Pharmingen™ 7-AAD | 559925 |
| Propidium Iodide Solution | 421301 | BD Pharmingen™ Propidium Iodide Staining Solution | 556463 |
| Monensin Solution (1,000X) | 420701 | BD GolgiStop™ Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | 554724 |
| Brefeldin A Solution (1,000X) | 420601 | BD GolgiPlug™ Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) | 555029 |
| Annexin V Binding Buffer | 422201 | BD Pharmingen™ Annexin V Binding Buffer, 10X concentrate | 556454 |
| RBC Lysis Buffer (10X) | 420301 | BD Pharm Lyse™ Lysing Buffer | 555899 |
| RBC Lysis/Fixation Solution (10X) | 422401 | BD Phosflow™ Lyse/Fix Buffer 5X | 558049 |
| FITC anti-mouse CD3ε | 155603 | BD Pharmingen™ Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | 553141 |
| Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution) | 422301 | BD Pharmingen™ Human BD Fc Block™ | 564219 |
| Cell Staining Buffer | 420201 | BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) | 554656 |
| Fixation Buffer | 420801 | BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation and Permeabilization Solution | 554722 |
| Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X) | 421002 | BD Perm/Wash™ Perm/Wash Buffer | 554723 |
| True-Nuclear™ Transcription Factor Buffer Set | 424401 | BD Pharmingen™ Mouse/Human FoxP3 Buffer Set | 560409/ 560098 |
| FluoroFix™ Buffer | 422101 | Stabilizing Fixative 3X Concentrate | 338036 |
| Cyto-Last™ Buffer | 422501 | None | |
| True-Nuclear™ Transcription Factor Buffer Set | 424401 | BD Pharmingen™ Transcription Factor Buffer Set | 562574 |
| True-Phos™ Perm Buffer | 425401 | BD Phosflow™ Perm Buffer III | 558050 |
| True-Stain Monocyte Blocker™ | 426101 | None | |
| Cyto-Fast™ Fix/Perm Buffer Set | 426803 | BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeabilization Kit | 554714 |
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Q6. 如何減少單核細胞與流式抗體的非特異性結合？
在對活細胞進行表面標記染色時，單核細胞和巨噬細胞會與螢光抗體產生非特異性結合。BioLegend 針對這個問題，精心研發配製出一種有效的阻斷劑——True-Stain Monocyte Blocker™（Cat#426101），這種基於非抗體的阻斷劑已驗證可以降低單核細胞結合螢光染料而產生的非特異性結合信號，而且不會影響單核細胞的特異性染色，如下圖所示。
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圖一、 True-Stain Monocyte Blocker™ 阻斷單核細胞與螢光染料的非特異性結合。在 5 µL/test 抗體/105細胞/100 µL染色體積條件下，加入（下列）or 不加入（上列）True-Stain Monocyte Blocker™ 對人 PBMCs 進行染色。
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此外，我們也一直在開發更多不同的緩衝液，以適用於不同的應用場景。例如串聯染料穩定劑 Tandem Stabilizer（Cat#421802）可應用於染色保存，有助於減少串聯染料的降解(圖二)。
圖二、Tandem Stabilizer 有助於減少串聯染料的降解。 (A) 用 anti-human CD4 (clone SK3) APC/Cyanine7 對人週邊血液淋巴細胞進行染色，然後用 FluroFix Buffer 固定1小時。(B) 用anti-human CD4 (clone SK3) APC/Cyanine7 對人週邊血液淋巴細胞進行染色，然後按照胞內細胞激素染色的建議步驟，使用（BioLegend Cat#420801）和Permeabilization Wash（BioLegend Cat#421002）對細胞進行固定與透化。(C）用anti-human CD4 (clone SK3) APC/Cyanine7對人週邊血液淋巴細胞進行染色，然後用True-Nuclear™ Transcription Factor Buffer Set 進行核內固定與透化染色。然後，A-C 的最後一個洗滌步驟用 Cell Staining Buffer配置成 1X Tandem Stabilizer working solution 對細胞進行離心，去除上清液，將細胞懸浮於 500µL 的 1X Tandem Stabilizer 中。細胞在染色完成當天（DAY 0）上機分析，或儲存對應時間（DAY 1）再上機分析。由於細胞處理和/或儲存時間，當細胞僅留在 Cell Staining buffer中時，APC/Cyanine7 串聯染料降解（例如 APC/Cyanine7 訊號轉變為 APC訊號）；然而，當細胞保存於含 Tandem Stabilizer 的 Cell Staining buffer 中，可以防止串聯染料降解的發生。
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總結：根據功能快速挑選適合的流式細胞實驗試劑
我們把 BioLegend 所有的試劑根據其功能性做了以下整理表，大家可以根據想要找的功能來挑選試劑！
| 功能 | 品名 | 型號 |
| 紅血球裂解 | RBC Lysis Buffer (10X) | 420301 |
| RBC Lysis/Fixation Solution (10X) | 422401 | |
| 染色緩衝液/沖洗液 | Cell Staining Buffer | 420201 |
| 非特異性位點阻斷/Fc受體阻斷 | Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution) | 422301 |
| Human TruStain FcX™, GMP | 423304 | |
| True-Stain Monocyte Blocker™ | 426101 | |
| 刺激細胞活化 | Cell Activation Cocktail (without Brefeldin A) | 423301 |
| 刺激細胞抑制 | Cell Activation Cocktail (with Brefeldin A) | 423303 |
| 胞內固定&破膜 | Cyto-Fast™ Fix/Perm Buffer Set | 426803 |
| 胞內固定劑 | Fixation Buffer | 420801 |
| 胞內破膜劑 | Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X) | 421002 |
| 核內固定&破膜 | True-Nuclear™ Transcription Factor Buffer Set | 424401 |
| FOXP3 Fix/Perm Buffer Set | 421403 | |
| 磷酸化指標破膜劑 | True-Phos™ Perm Buffer | 425401 |
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更多緩衝液，可查閱BioLegend網站（LINK）瞭解更詳細的產品資訊，或聯繫 BioLegend 的應用科學家 (vera.chiu@biolegend.com) 一起討論詳細的產品應用問題，期待您的來信！
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