細胞凋亡與細胞健康檢測工具系列之一
Oct 2023 BioLegend x 昶安專欄
細胞凋亡與細胞健康檢測工具系列之一
對於研究人員來說，細胞的健康度是非常重要，原因包括：想要評估樣本的活力和完整性；可能正在研究細胞凋亡的分子機制；或者希望追蹤細胞的增生和遷移。為此我們提供一系列相關的研究工具來幫助研究人員實現這些目標，並提供適合每個研究項目的多種選擇。
- 死/活細胞指示劑：可固定型（Zombie Dyes）和不可固定型（7-AAD、PI、Helix NP™）。
- 死細胞去除：可以從樣本中移除死細胞和碎片的試劑組。
- 細胞凋亡指標：鈣非依賴性探針 (Apotracker™) 和依賴性探針 (Annexin V)。
- 用於細胞增生、長期和短期追蹤細胞、細胞週期分析和粒線體染色的其他試劑。
死/活細胞指示劑
流式技術應用時，評估細胞的活力和整體健康狀況非常重要。細胞狀況不佳或死亡的細胞會產生碎片，導致流式細胞儀實驗中出現假陽性染色。大多數死/活細胞指示劑都基於這樣的概念：完整的活細胞膜有助於限制螢光染料或化學探針的結合。了解以下每個類別中的非抗體化學探針，以幫助您進一步選擇哪一種試劑最適合您的研究方案。
實驗規劃 |
策略 |
|
|
→ |
PI, 7-AAD, 或Zombie Dyes |
|
→ |
固定前先加入Zombie Dyes |
|
→ |
抗體染色與細胞固定前先加入Zombie Dyes |
|
→ |
固定之前先加入Zombie Dyes |
|
→ |
無適用的死活細胞指示劑 |
可固定的死/活細胞指示劑
固定和透化試劑（例如：酒精和福馬林）可以使 DNA 解旋和變性，使已與DNA 結合的染料脫落並產生假陰性結果。同時，遊離的染料可能會進入檢體中原本健康的細胞，而這些細胞現在已經被固定/透化，因而造成假陽性的結果。
為了避免這個問題，BioLegend提供了Zombie Dyes，它可以結合蛋白質上存在的胺基。死細胞由於內部蛋白質豐富，一旦死細胞膜受損，染劑因而可進入胞內染色，反之，活細胞因表面蛋白質而被染色的程度相較於死細胞來的低很多，透過這樣的染色機制，我們可以簡易地分辨死活細胞。
不可固定的死活細胞指示染劑
識別死細胞的最早技術之一是使用核酸結合染料，例如PI、7-AAD、DAPI 和 BioLegend 的 Helix NP™系列（非滲透性）染料 (圖一、二)。 這些染料的作用機制是活的/健康的細胞擁有完整的細胞膜，可以防止這些染料進入細胞核。 然而，細胞狀況不佳或死細胞的細胞膜受損，使這些染料能夠直接穿過細胞膜並與核內的DNA結合。需要特別注意可能會發生的問題是，固定和透化程序都可能會導致這些染料與核酸解離。
圖一、使用Helix NP™ NIR對一日齡的 C57 小鼠脾臟細胞進行染色（紫色區域）。 未經 Helix NP™ NIR 染色的脾臟細胞（未塗色區域）。
圖二、一日齡的 C57BL/6 小鼠脾臟細胞使用5 µM Helix NP™ Green和 APC Annexin V進行染色，未經過清洗步驟。
死細胞去除
檢體所含的死細胞或碎片會干擾正確的實驗數據。尤其是死細胞，它可以與抗體非特異性地結合，例如在應用單細胞定序多組學時，死細胞會佔用文庫中寶貴的讀數。這個是侯研究人員就可以利用以下的方式，從樣本中去除死細胞後，再進行下游分析例如單細胞定序或流式技術應用等。
MojoSort™ Human and Mouse Dead Cell Removal Kits (Cat#480159 & Cat#480157)
死細胞在不含鈣的細胞分離緩衝液（MojoSort™緩衝液或等效物; Cat#480017）中進行磁性分離，實現高富集活細胞以及優異的產量和細胞回收率 (圖三)。
圖三、競廠產品 A 和 MojoSort™ 小鼠死細胞去除試劑組之間的活細胞回收率比較。依照各試劑盒所建議的操作步驟使用之。將加熱導致死細胞增加的 C57BL/6小鼠脾臟細胞（約含40%死細胞）進行磁性分離。競廠A產品需要使用含有高Ca2+濃度的專用結合緩衝液。活細胞百分比是根據分選後的CD45+ Helix NP™ Blue- Apotracker™ Green-細胞群相較於分選前的細胞計算而得的數據。數據為二重複實驗所得。
[實際應用範例] 經過 MojoSort™ Human Dead Cell Removal Kit 去除死細胞後，細胞接著進行 scRNA-seq 和 CITE-seq 應用
活細胞富集後的樣品可應用於各種研究，尤其是非常重視細胞活性的分析技術，例如進行單細胞 RNA 定序 (single-cell RNA sequencing; scRNA-seq)、或使用我們的 TotalSeq™ oligonucleotide conjugated antibodies 並應用在轉錄組和表位定序 (Cellular Indexing of Transcriptomics and Epitomics, CITE-seq) 上 (圖四、五)。
圖四、在同一個CITE-seq 實驗中彙集了三種細胞樣本：來自健康捐贈者的新鮮人類 PBMC、存活率60%的 PBMCs、存活率60%的 PBMCs 並經過 MojoSort™ Human Dead Cell Removal Kit 去除死細胞的 PBMC。(A)定序資料庫中粒線體讀取百分比較高的細胞通常被認為具有較低的細胞活力。這些死亡和垂死細胞在存活率60% PBMC組中含量豐富，透過 MojoSort™ Human Dead Cell Removal Kit 可以去除這些訊息。(B) 根據TBNK表面標記分析的 UMAP 顯示，三個樣本中都可以檢測到常見的PBMC細胞族群，但中心的死細胞群則無法分群TBNK，死細胞群主要由來自存活率60%的PBMC組別。(C) 與細胞分群相對應每個細胞的粒線體讀數百分比，表示圖中的紅色細胞群為是死亡和垂死的細胞。
圖五、經過 MojoSort™ Human Dead Cell Removal Kit 去除死細胞的 PBMC 仍保留了 PBMC 中所有常見的表面標記，與新鮮 PBMC 組進行比較時，TBNK 標記物的表達量相似。
BioLegend昶安獨家代理
點擊下列連接了解更多：